BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: SÀNG LỌC VI KHUẨN Bacillus SINH BACTERIOCIN ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ CBHD: ThS. Nguyễn Văn Minh SVTH: Lê Quỳnh Yến Nhi MSSV: 105 301 2530 Khóa: 2010 – 2014 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Mở TP.HCM luôn sẵn sàng truyền đạt những kiến thức cơ bản cũng như chuyên sâu trong lĩnh vực sinh học để giúp em làm cơ sở cho nghiên cứu sau này. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh và cô Dương Nhật Linh đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ kinh nghiệm, tạo những điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và có thể thực hiện tốt đề tài tại phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh của trường Đại Học Mở TP.HCM. Xin ghi nhớ công ơn của Cha Mẹ đã không quản mọi gian lao khó nhọc và sự hy sinh cao cả để cho con có được ngày hôm nay. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới những người thân yêu, bạn bè, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh và các anh chị trong phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh đã động viên giúp đỡ và đóng góp những ý kiến của mình cho bài báo cáo thực tập tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn! KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ v DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................ vi ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 PHẦN I: TỔNG QUAN ........................................................................................... 5 1.1. TổNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS ............................................... 6 1.1.1. Phân loại ............................................................................................... 6 1.1.2. Khái niệm ............................................................................................. 6 1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố trong tự nhiên ..................................... 6 1.1.4. Dinh dưỡng và sự phát triển của Bacillus ............................................ 8 1.1.5. Ứng dụng của Bacillus ......................................................................... 9 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN GÂY BỆNH .......................................... 10 1.2.1. Staphylococcus aureus ....................................................................... 10 1.2.2. Escherichia coli.................................................................................. 11 1.2.3. Salmonella typhi ................................................................................. 12 1.2.4. Streptococcus faecalis ........................................................................ 13 1.2.5. Listeria monocytogenes...................................................................... 14 1.3. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN......................................................... 15 1.3.1. Giới thiệu chung về bacteriocin ......................................................... 15 1.3.2. Phân loại bacteriocin của chi Bacillus ............................................... 16 1.3.3. Tính chất của Bacillus bacteriocin ..................................................... 18 1.3.4. Hoạt động của bacteriocin.................................................................. 19 1.3.5. Tính đối kháng và phương pháp xác định tính đối kháng ................. 20 1.3.6. Sinh tổng hợp bacteriocin .................................................................. 22 1.3.7. Các ứng dụng của Bacillus bacteriocin .............................................. 23 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................... 31 2.1. VẬT LIỆU ................................................................................................ 32 2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................... 32 2.1.2. Chủng vi khuẩn dùng thử nghiệm ...................................................... 32 2.1.3. Vật liệu và hóa chất ............................................................................ 32 SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI i KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 33 2.2.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................ 33 2.2.2. Định tính khả năng sinh bacteriocin .................................................. 34 2.2.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin ............................... 36 2.2.4. Tác động của các nhiệt độ và độ pH trên hoạt tính kháng khuẩn ...... 37 2.2.5. Định danh ........................................................................................... 38 2.2.6. Xác định nồng độ pha loãng thấp nhất của dịch bacteriocin thô còn ức chế với vi khuẩn chỉ thị ................................................................................... 46 2.2.7. Thử nghiệm bacteriocin như chất bảo quản sinh họctrong sữa ......... 48 2.2.8. Phương pháp thống kê........................................................................ 49 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 50 3.1. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS .......................................................................................................... 51 3.1.1. Định tính khả năng sinh bacteriocin bằng phương pháp đổ thạch hai lớp: ............................................................................................................ 51 3.1.2. Định tính khả năng sinh bacteriocin bằng phương pháp khuếch tán trên thạch theo mô tả của Tagg & Mac-Given (1971) .................................... 52 3.2. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA BACTERIOCIN .... 54 3.3. TÁC ĐỘNG CỦA CÁC NHIỆT ĐỘ VÀ ĐỘ pH TRÊN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN .............................................................................................. 56 3.3.1. Nhiệt độ .............................................................................................. 57 3.3.2. pH ....................................................................................................... 60 3.4. ĐỊNH DANH CHỦNG BACILLUS CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN MẠNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG THEO KHÓA PHÂN LOẠI CỦA COWAN VÀ STEEL (1993) .......................................................... 64 3.5. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG THẤP NHẤT CỦA DỊCH BACTERIOCIN THÔ CÒN ỨC CHẾ VỚI VI KHUẨN CHỈ THỊ .................. 66 3.6. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM BACTERIOCIN THU ĐƯỢC NHƯ CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC TRONG SỮA ........................................................... 66 3.7. TÓM TẮT ................................................................................................. 68 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀĐỀ NGHỊ ................................................................... 70 4.1. Kết luận ........................................................................................................ 71 4.2. Đề nghị:........................................................................................................ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 72 SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC PHỤ LỤC ............................................................................................................... 82 SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại bacteriocin của Bacillus, ví dụ, và so sánh với phân loại của LAB bacteriocin ..................................................................................................... 18 Bảng 3.1 Kết quả xác định khả năng sinh bacteriocin của các chủng Bacillus ..... 51 Bảng 3.2 Kết quả xác định khả năng sinh bacteriocin của các chủng Bacillus dựa vào đường kính vòng vô khuẩn (ɸ = mm) ............................................................. 53 Bảng 3.3: Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin của vi khuẩn thử nghiệm (AU/mL) .............................................................................................. 55 Bảng 3.4 Kết quả tác động của các nhiệt độ trên hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin của chủng K3 (%) ................................................................................ 57 Bảng 3.5 Kết quả tác động của các nhiệt độ trên hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin của chủng T3P (%) .............................................................................. 59 Bảng 3.6 Kết quả tác động của các độ pH trên hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin của chủng thử nghiệm K3(%) .............................................................. 61 Bảng 3.7 Kết quả tác động của các độ pH trên hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin của chủng thử nghiệm T3P (%) ........................................................... 62 Bảng 3.8 Kết quả định danh sinh hóa ..................................................................... 65 Bảng 3.9 Kết quả xác định nồng độ pha loãng thấp nhất của dịch bacteriocin thô còn ức chế với vi khuẩn chỉ thị (tỉ lệ so với nồng độ ban đầu) .............................. 66 Bảng 3.10 Kết quả thử nghiệm bacteriocin như chất bảo quản sinh học trong sữa của các chủng thử nghiệm ở nhiệt độ thường (giờ)................................................ 67 SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Hình dạng của một loài thuộc chi Bacillus .............................................. 7 Hình 1.2: Staphylococcus aureus ........................................................................... 11 Hình 1.3: Escherichia coli ...................................................................................... 12 Hình 1.4: Salmonella typhi ..................................................................................... 13 Hình 1.5: Streptococcus faecalis ............................................................................ 13 Hình 1.6: Listeria monocytogenes .......................................................................... 14 Hình 2.1: Kết quả vòng vô khuẩn........................................................................... 36 Hình 3.1Kết quả định tính khả năng sinh bacteriocin bằng phương pháp đổ thạch hai lớp ..................................................................................................................... 52 Hình 3.2 Kết quả định tính khả năng sinh bacteriocin bằngphương pháp khuếch tán trên thạch .......................................................................................................... 54 Hình 3.3 Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩncủabacteriocin .......................... 56 Hình 3.4 a: sữa bị hư hỏng; b: sữa bình thường ..................................................... 68 SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI v KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC DANH MỤC VIẾT TẮT ANOVA: One-way analysis of variance BHI: Brain heart infusion BLIS: Bacteriocin-like inhibitory subtances CFU: Colony Forming Unit- Đơn vị hình thành khuẩn lạc LAB: Lactic acid bacteria NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth MHA: Mueller hinton agar MHB: Mueller hinton broth OD: Optical Density L.monocytogenes: Listeria monocytogenes S.faecalis: Streptococcus feacalis S.typhi: Salmonella typhi S.aureus: Staphylococcus aureus Ecoli: Escherichia coli o C: Celsius degree SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề luôn được mọi người quan tâm, nhất là với tình hình hiện nay. Đời sống xã hội ngày càng tăng cao dẫn tới nhu cầu ăn uống của con người cũng ngày được nâng cao. Vì thế vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm được chú trọng và đẩy mạnh. Tình trạng thực phẩm bị nhiễm khuẩn ngày càng phổ biến và gây thiệt hại lớn cho công ty thực phẩm cũng như sức khỏe người tiêu dùng. Có rất nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm như: do vi sinh vật, nguyên liệu và sản phẩm chứa độc tố, các quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, chất phụ gia, phân hóa học và thuốc bảo vệ thực vật... Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 20-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 – 200 ca tử vong. Nhà nước cũng phải chi trên 3 tỉ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân. Tiền thuốc men và viện phí cho mỗi nạn nhân ngộ độc do vi sinh vật tốn chừng 300.000 – 500.000 đồng, các ngộ độc do hóa chất (thuốc trừ sâu, phẩm màu…) từ 3 – 5 triệu đồng. Các hoá chất bảo quản là những hợp chất tự nhiên hoặc là những hợp chất hóa học tổng hợp. Những hợp chất bảo quản tự nhiên thường lưu giữ được dưỡng chất và mùi vị của thực phẩm và ít ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Còn các loại hóa chất để bảo quản thực phẩm có ưu điểm là: lưu giữ thực phẩm lâu, giúp cho việc kinh doanh trở nên dễ dàng và thu lại được nhiều lợi nhuận. Tuy nhiên vì những hóa chất này cũng có những tác hại nhất định nên chúng chỉ được phép thêm vào ở một nồng độ hạn chế cho phép. Song dường như những người buôn bán không hề quan tâm tới điều này và cố tình lờ đi. Điều này đã dẫn đến những hệ lụy cho sức khỏe con người. Theo Nguyễn Duy Thịnh, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, formaldehyde là chất kịch độc, không được sử dụng cho bất kỳ sản phẩm nào, đồng thời không được sử dụng làm phụ gia thực phẩm. Tuy nhiên, vì có tính sát trùng cao nên vẫn được gian thương sử dụng. Các loại thực phẩm được ngâm formaldehyde sẽ kích thích gây cay niêm mạc mắt, đỏ mắt, kích thích đường hô hấp trên gây chảy mũi, viêm SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ thanh quản, viêm đường hô hấp, hen phế quản, viêm phổi. Đây cũng là một chất hoá học gây ra tình trạng quái thai rất mạnh. Và còn rất nhiều những tác hại nghiêm trọng khác. Do đó, vấn đề thay thế chất bảo quản hóa học bằng những sản phẩm tự nhiên để cải thiện an toàn sinh học và tăng thời gian bảo quản thực phẩm với việc sử dụng các loài vi sinh vật không gây bệnh và những chất chuyển hóa của chúng, được yêu cầu ngày càng cao. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, tích điện dương, có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt và có khả năng ức chế vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng. Nhiều bacteriocin trong chi Bacillus đã được báo cáo như subtilin của B.subtilis (Banerjee và cộng sự, 1988), megacin của B.megaterium (Korenblumvà cộng sự, 2008), một số bacteriocin của B.cereus (Pariot và cộng sự, 2008) một số bacteriocin của B.thuringiensis (Paik và cộng sự, 1997, Paik và cộng sự, 2000). Một nghiên cứu gần đây nhất của Kaewklom và cộng sự (2013) đã báo cáo rằng amysin của vi khuẩn B.amyloliquefaciens có khả năng kiểm soát L.monocytogenes trên sản phẩm thịt xông khói (Kellner và cộng sự, 1989) Vì vậy, việc sàng lọc Bacillus sản xuất bacteriocin được coi là một trong những lợi ích lớn trong nghiên cứu bảo quản thực phẩm. Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc Bacillus sinh bacteriocin ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”. Mục tiêu: Cung cấp thêm nguồn sản xuất bacteriocin mới ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nội dung thực hiện: – Định tính khả năng sinh bacteriocin của các chủng thử nghiệm – Xác định hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin thu nhận từ các chủng thử nghiệm với vi khuẩn chỉ thị (L.monocytogenes, S.feacalis, S.typhi, S.aureus, E.coli) SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ – Tác động của các nhiệt độ và độ pH trên hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với vi khuẩn chỉ thị – Định danh bằng phương pháp sinh hóa cho các chủng có hoạt tính cao – Xác định nồng độ pha loãng thấp nhất của dịch bacteriocin thô còn ức chế với vi khuẩn chỉ thị – Thử nghiệm bacteriocin thu được như chất bảo quản sinh học trong sữa SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN PHẦN I: TỔNG QUAN SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS 1.1.1. Phân loại Theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Holt và cộng sự, 2000), Bacillus phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus 1.1.2. Khái niệm Từ “Bacillus” nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dưới kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là “hình que”. Do đó, một số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn. Tuy nhiên, “Bacillus” là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc về họ: Bacillaceae ngành: Firmicutes. Chúng có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, khi gặp điều kiện bất lợi hay ở cuối thời kỳ phát triển tự nhiên, chúng có khả năng tạo bào tử, để tồn tại trong trạng thái “ngủ đông” trong thời gian dài. Các thành viên của chiBacillus được biết như là một “kho vũ khí” để sản xuất các chất kháng khuẩn, trong đó có peptide và lipopeptide, kháng sinh và bacteriocin. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố trong tự nhiên Chi Bacillus bao gồm 51 loài đã được định danh và một số loài chưa được phân loại rõ ràng, trong đó đa số các loài là vô hại. SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN Hầu hết Bacillus là vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính nhau thành chuỗi ngắn. Tuy nhiên, cũng có một số loài Bacillus là Gram âm hay Gram dương yếu như B.horti, B.oleronius, B.azotoformans, B.thermosphaericus; không tạo bào tử như B.halodenitrificans, B.thermoamylovorans; dạng vi khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc như B.infernus. Hình 1.1: Hình dạng của một loài thuộc chi Bacillus Bacillus là vi khuẩn có nhiều loại kiểu hình và kiểu gen không đồng nhất (Stein và cộng sự, 2002) và do đó, chúng thể hiện tính chất sinh lý khá đa dạng như khả năng làm suy giảm nhiều chất khác nhau có nguồn gốc từ thực vật và động vật, bao gồm cả cellulose, tinh bột, protein, thạch, hydrocarbon và cả nhiên liệu sinh học cũng vậy (Martirani và cộng sự, 2002). Hơn nữa, một số loài vi khuẩn Bacillus là dị dưỡng nitơ, khử nitơ, cố định nitơ, kết tủa sắt, oxy hóa selenium, chất oxy hóa, giảm thiểu mangan, dinh dưỡng hóa năng vô cơ tuỳ ý, ưa acid, ưa kiềm, ưa lạnh, ưa nhiệt...(Sass và cộng sự, 2008). Sự đa dạng trong đặc tính sinh lý, được phản ánh bởi sự đa dạng của các chủng vi khuẩn Bacillus, do đó cho phép các vi khuẩn tồn tại và xâm chiếm một loạt các môi trường sinh thái. Khả năng đa dạng hóa sinh thái đã được tăng cường bởi việc sản xuất bào tử, được đặc trưng bởi khả năng vượt trội của nó về sức đề kháng và trạng thái ngủ. SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN Bacillus hình trực, đầu tròn hoặc vuông, kích thước từ 0,5-1,2 x 2,5 – 10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài. Đối với Bacillus có nội bào tử thì bào tử hình trụ, oval, tròn hoặc bầu dục. Tùy loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc cuối, túi bào tử phòng hoặc không phồng. Sự tạo thành nội bào tử được chấp nhận như là một đặc tính cơ bản để phân loại và xác định các thành viên của chi, nhờ các nghiên cứu về B.subtilis của Cohn, trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B. anthracis năm 1976 của Kock(Chang và cộng sự, 2003) Hầu hết các loài Bacillus đều di động (trừ B.anthracis và B.mycoides) mặc dù có sự khác biệt về khả năng di động của mỗi loài. Đa số các loài cho phản ứng catalase dương tính. Bacillusđược tìm thấy trong nhiều môi trường như đất và đất sét, đá, bụi, môi trường nước, thực vật, thực phẩm và đường tiêu hóa của loài côn trùng và động vật (Xie và cộng sự, 2009). Khả năng để tồn tại và phát triển trong các hệ sinh thái khác nhau như vậy là dựa trên việc sinh bào tử mạnh mẽ, sự đa dạng trong các thuộc tính sinh lý và yêu cầu tăng trưởng của chúng. 1.1.4. Dinh dưỡng và sự phát triển của Bacillus 1.1.4.1. Môi trường nuôi cấy Phần lớn các chi Bacillus có thể phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản: NB, NA..., mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt môi trường cần được điều chỉnh pH hoặc nồng độ muối. Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút. Trong môi trường nuôi cấy lỏng, chúng tạo váng trên bề mặt. Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dáng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề mặt khóm sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch(Chang và cộng sự, 2003) Hình dáng khuẩn lạc thay đổi theo độ tuổi, các đĩa cấy riêng lẻ có thể tạo ra các dạng khuẩn lạc khác nhau.Một số loài Bacillus khi nuôi cấy cần bổ sung một số SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN thành phần như: B.larvae và B.poliliae trong môi trường nuôi cấy bổ sung thêm thiamine,B.stearothermophilus bổ sung calci và sắt(Kaewklom và cộng sự, 2013) Hầu hết các loài Bacillus cần môi trường đặc biệt để có thể thúc đẩy việc tạo bào tử. Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng thấp, đặc biệt là thiếu nguồn carbon, nitrogen, hoặc phospho. Môi trường nhân tạo để cảm ứng tạo bào tử thường thấy là Difico sporulation agar (DSM) 2xSG agar(Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008) 1.1.4.2. Nhiệt độ phát triển Phần lớn Bacillus ưa nhiệt độ trung tính và tạo khuẩn lạc đặc trưng sau khi nuôi cấy 37oC/ 24 giờ. Tuy nhiên, cũng có những loài ưa nhiệt chỉ có thể phát triển từ 55 đến 70oC (B.stearothermophilus). B.coagulans là loài ưa nhiệt trung bình, phát triển tốt tại 45-50oC. B.larvae, B popilliae phát triển ở 25 – 30oC (Kaewklom và cộng sự, 2013) 1.1.5. Ứng dụng của Bacillus Bacillus được ứng dụng nhiều trong y khoa, dược phẩm, thực phẩm, quy trình nông nghiệp, công nghiệp, môi trường nhờ tận dụng lợi thế về đặc điểm sinh lý và khả năng của chúng để sản xuất một loạt các loại bacteriocin/ BLIS như: haloduracin, lichenicidin, mersacidin, subtilosin A, thuricin CD,…; enzym như: amylase, cellulase, lipase, serine, protease, chitinase, alkaline phosphatase...; kháng sinh như: bacitracin và polymycin là hai kháng sinh nổi tiếng thu được từ vi khuẩn Bacillus, surfactin vừa có hoạt tính kháng khuẩn vừa có tính diện hoạt mạnh, subtilin có hoạt tính kháng khuẩn, kháng khối u...; và nhiều chất chuyển hóa khác như: gluanilic acid, nucleotide xanthanylic acid, guanilic acid... Một số loài còn được sử dụng làm tiêu chuẩn trong xét nghiệm y tế và dược phẩm, đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải tự nhiên hoặc nhân tạo các chất thải, làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzym, acid amin, vitamin và polysaccharide. SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN Các bào tử của B.stearothermophilus được sử dụng để kiểm tra khử trùng nhiệt, và B.subtilis subsp globigii với khả năng chịu nhiệt, hóa chất và bức xạ, được sử dụng rộng rãi để xác nhận việc khử trùng và khử trùng thay thế. Một số tác nhân gây bệnh côn trùng của Bacillus được sử dụng như là thành phần của thuốc trừ sâu (B.thuringiensis). B.thuringiensis subsp. làm chế phẩm israelensisserotype H14 diệt lăng quăng. Bacillus spp. được sử dụng làm probiotic cho người, chăn nuôi và thủy sản nhờ khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenza, Candida albicans, E.coli, S.aureus, Shigella, Vibrio spp., Ví như: B. polyfermenticus SCD (polyfermenticin sản xuất SCD) là một probiotic thương mại để điều trị rối loạn đường ruột dài hạn ở người do hoạt động ức chế của nó đối với C.perfringens; bào tử của B.amyloliquefaciens CECT 5940 được sử dụng như một probiotic trong thức ăn gia cầm (Ecobiols, Norel & Nature Nutrition) hoạt động trong đường ruột của gia cầm, làm giảm hiệu lực của vi khuẩn gây bệnh như C.perfringens, E.coli và Yersinia, do đó làm giảm tỷ lệ tử vong gia cầm…B.subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người (Martirani và cộng sự, 2002) Một số chủng Bacillus như B.laterosporus, B.firmus và B.cereusđang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate). B.pasteurii đưa vào đất ướt tạo ra calcite-một chất liên kết xi măng với đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững móng các tòa nhà, giúp chống chịu động đất (Martirani và cộng sự, 2002) 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN GÂY BỆNH 1.2.1. Staphylococcus aureus Phân loại: Giới: Prokaryote SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN Ngành: Firmicute Lớp: Firmibacteria Họ: Micrococceae Chi: Staphylococcus Loài: Staphylococcus aureus (Holt, 2000) Hình 1.2: Staphylococcus aureus S.aureus là vi khuẩn Gram dương, hình (Nguồn: www.phil.cdc.gov) cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho. Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 – 5 mm. S.aureus gây ra hai loại hội chứng nhiễm độc và nhiễm trùng: – Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S.aureus (độc tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn như: hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn. – Nhiễm trùng là do S.aureus xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị tổn thương hay giảm chức năng như: nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng hệ hô hấp, nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, nhiễm trùng xương… S.aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người. Chúng thường xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt; gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng như: viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim. (Lê Văn Phủng, 2012) 1.2.2. Escherichia coli SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN Phân loại: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia Loài: Escherichia coli (Holt, 2000) E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước Hình 1.3: Escherichia coli trung bình từ 2 – 3 µm x 0,5 µm; trong những (Nguồn: www.theguardian.com) điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động. E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường , hiếu khí tùy nghi, nhiệt độ từ 5 – 40oC. Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. E.coli là vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hóa của người, có thể được tìm thấy ở đường hô hấp trên hay đường sinh dục. E.coli đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E.coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà bình thường chúng không hiện diện. E.coli hội sinh có trong phân người khỏe mạnh chỉ gây bệnh khi có dị vật hay hệ thống miễn dịch của ký chủ bị suy yếu. E.coli gây bệnh đường ruột. Tác nhân gây bệnh qua đường tiêu hóa bất cứ khi nào ký chủ nuốt vào đủ số lượng vi khuẩn. Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác. (Lê Văn Phủng, 2012) 1.2.3. Salmonella typhi SVTH: LÊ QUỲNH YẾN NHI 12